Interferensfaktorer i PCR-reaktioner

Under PCR-reaktionen støder man ofte på nogle forstyrrende faktorer.
På grund af PCR's meget høje følsomhed anses kontaminering for at være en af ​​de vigtigste faktorer, der påvirker PCR-resultater og kan give falsk positive resultater.
Lige så kritisk er de forskellige kilder, der fører til falsk-negative resultater. Hvis en eller flere væsentlige dele af PCR-blandingen eller selve amplifikationsreaktionen hæmmes eller forstyrres, kan det diagnostiske assay blive forhindret. Dette kan føre til reduceret effektivitet og endda falske negative resultater.
Ud over inhibering kan tab af målnukleinsyreintegritet forekomme på grund af forsendelses- og/eller opbevaringsforhold før prøveforberedelse. Især kan høje temperaturer eller utilstrækkelig opbevaring føre til beskadigelse af celler og nukleinsyrer. Celle- og vævsfiksering og paraffinindlejring er velkendte årsager til DNA-fragmentering og et vedvarende problem (se figur 1 og 2). I disse tilfælde vil selv optimal isolering og oprensning ikke hjælpe.

Figur 1 | Virkning af immobilisering på DNA-integritet
Agarosegelelektroforese viste, at kvaliteten af ​​DNA'et isoleret fra paraffinsnit af obduktioner varierede betydeligt. DNA af forskellige gennemsnitlige fragmentlængder var til stede i ekstrakterne afhængigt af fikseringsmetoden. DNA blev kun bevaret, når det fikseres i native frosne prøver og i bufferet neutralt formalin. Anvendelsen af ​​et stærkt surt Bouin-fikseringsmiddel eller ubufret, myresyreholdigt formalin resulterede i et signifikant tab af DNA. Den resterende fraktion er meget fragmenteret.
Til venstre er længden af ​​fragmenter udtrykt i kilobasepar (kbp)

Figur 2 | Tab af integritet af nukleinsyremål
(a) Et 3′-5′ mellemrum på begge strenge vil resultere i et brud i mål-DNA'et. syntese af DNA vil stadig forekomme på det lille fragment. Men hvis et primer-annealingssted mangler på DNA-fragmentet, sker der kun lineær amplifikation. I det mest gunstige tilfælde kan fragmenterne genmætte hinanden, men udbytterne vil være små og under detektionsniveauer.
(b) Tab af baser, hovedsageligt på grund af depurinering og thymidindimerdannelse, fører til et fald i antallet af H-bindinger og et fald i Tm. Under den forlængede opvarmningsfase vil primerne smelte væk fra matrix-DNA'et og vil ikke anneale selv under mindre stringente betingelser.
(c) Tilstødende thyminbaser danner en TT-dimer.
Et andet almindeligt problem, der ofte opstår i molekylær diagnostik, er den mindre end optimale frigivelse af målnukleinsyrer sammenlignet med phenol-chloroform-ekstraktion. I ekstreme tilfælde kan dette være forbundet med falske negativer. Meget tid kan spares ved kogende lysis eller enzymatisk fordøjelse af cellerester, men denne metode resulterer ofte i lav PCR-følsomhed på grund af utilstrækkelig frigivelse af nukleinsyre.

Hæmning af polymeraseaktivitet under amplifikation

Generelt bruges inhibering som et beholderkoncept til at beskrive alle faktorer, der fører til suboptimale PCR-resultater. I en streng biokemisk forstand er inhibering begrænset til enzymets aktivitet, dvs. den reducerer eller forhindrer substrat-produktomdannelse gennem interaktion med det aktive sted af DNA-polymerasen eller dens cofaktor (f.eks. Mg2+ for Taq DNA-polymerase).
Komponenter i prøven eller forskellige buffere og ekstrakter, der indeholder reagenser, kan direkte hæmme enzymet eller fange dets cofaktorer (f.eks. EDTA), og derved inaktivere polymerasen og igen føre til nedsatte eller falsk negative PCR-resultater.
Imidlertid betegnes mange interaktioner mellem reaktionskomponenter og målholdige nukleinsyrer også som 'PCR-hæmmere'. Når først cellens integritet er forstyrret ved isolering, og nukleinsyren frigives, kan der forekomme interaktioner mellem prøven og dens omgivende opløsning og fast fase. For eksempel kan 'scavengers' binde enkelt- eller dobbeltstrenget DNA gennem ikke-kovalente interaktioner og interferere med isolering og oprensning ved at reducere antallet af mål, der til sidst når PCR-reaktionsbeholderen.
Generelt er PCR-hæmmere til stede i de fleste kropsvæsker og reagenser, der anvendes til kliniske diagnostiske tests (urinstof i urin, hæmoglobin og heparin i blod), kosttilskud (organiske komponenter, glykogen, fedt, Ca2+ ioner) og komponenter i miljøet (phenoler). , tungmetaller)

Mere udbredte PCR-hæmmere kan findes i bakterier og eukaryote celler, ikke-mål-DNA, DNA-bindende makromolekyler af vævsmatricer og laboratorieudstyr såsom handsker og plastik. Oprensning af nukleinsyrer under eller efter ekstraktion er den foretrukne metode til fjernelse af PCR-inhibitorer.
I dag kan forskelligt automatiseret ekstraktionsudstyr erstatte mange manuelle protokoller, men 100 % genvinding og/eller oprensning af mål er aldrig blevet opnået. Potentielle inhibitorer kan stadig være til stede i de oprensede nukleinsyrer eller kan allerede være trådt i kraft. Der findes forskellige strategier for at reducere virkningen af ​​inhibitorer. Valget af den passende polymerase kan have en betydelig indvirkning på inhibitoraktivitet. Andre gennemprøvede metoder til at reducere PCR-hæmning er at øge polymerasekoncentrationen eller anvende tilsætningsstoffer såsom BSA.
Hæmning af PCR-reaktioner kan påvises ved brug af intern proceskvalitetskontrol (IPC).
Der skal udvises omhu for at fjerne alle reagenser og andre opløsninger i ekstraktionssættet, såsom ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol og phenol, fra nukleinsyreisolatet ved et grundigt vasketrin. Afhængigt af deres koncentration kan de aktivere eller hæmme PCR.