Interferensfaktorer i PCR -reaktioner

Under PCR -reaktionen opstår ofte nogle forstyrrende faktorer.
På grund af den meget høje følsomhed af PCR betragtes kontaminering som en af ​​de vigtigste faktorer, der påvirker PCR -resultater og kan give falske positive resultater.
Lige kritiske er de forskellige kilder, der fører til falsk-negative resultater. Hvis en eller flere essentielle dele af PCR -blandingen eller selve amplifikationsreaktionen hæmmes eller forstyrres, kan det diagnostiske assay hindres. Dette kan føre til reduceret effektivitet og endda falske negative resultater.
Ud over inhibering kan tab af målnukleinsyreintegritet forekomme på grund af forsendelse og/eller opbevaringsbetingelser inden prøveforberedelse. Især kan høje temperaturer eller utilstrækkelig opbevaring føre til skader på celler og nukleinsyrer. Celle- og vævsfiksering og paraffinindlejring er velkendte årsager til DNA -fragmentering og et vedvarende problem (se figur 1 og 2). I disse tilfælde vil selv optimal isolering og oprensning ikke hjælpe.

Figur 1 | Effekt af immobilisering på DNA -integritet
Agarosegelelektroforese viste, at kvaliteten af ​​DNA isoleret fra paraffinsektioner af obduktioner varierede betydeligt. DNA af forskellige gennemsnitlige fragmentlængder var til stede i ekstrakterne afhængigt af fikseringsmetoden. DNA blev kun konserveret, når den blev fikseret i indfødte frosne prøver og i bufret neutral formalin. Anvendelsen af ​​et stærkt surt bouin-fikseringsmiddel eller ubuffet, myresyreholdige formalin resulterede i et betydeligt tab af DNA. Den resterende fraktion er meget fragmenteret.
Til venstre udtrykkes fragmenternes længde i kilobasepar (KBP)

Figur 2 | Tab af integritet af nukleinsyremål
(A) Et 3′-5 ′ -gap på begge tråde vil resultere i en pause i målet DNA. Syntese af DNA vil stadig forekomme på det lille fragment. Men hvis der mangler et primerglødningssted på DNA -fragmentet, forekommer der kun lineær amplifikation. I det mest gunstige tilfælde kan fragmenterne resættes hinanden, men udbyttet vil være små og under detektionsniveauer.
(b) Tab af baser, hovedsageligt på grund af depurination og dannelse af thymidindomer, fører til et fald i antallet af H-bindinger og et fald i TM. I den langstrakte opvarmningsfase smelter primere væk fra matrix -DNA og vil ikke annealere, selv under mindre strenge forhold.
(c) Tilstødende thyminbaser danner en TT -dimer.
Et andet almindeligt problem, der ofte forekommer i molekylær diagnostik, er den mindre end optimale frigivelse af målnukleinsyrer sammenlignet med phenol-chloroform-ekstraktion. I ekstreme tilfælde kan dette være forbundet med falske negativer. Meget tid kan reddes ved kogende lysis eller enzymatisk fordøjelse af celleaffald, men denne metode resulterer ofte i lav PCR -følsomhed på grund af utilstrækkelig frigivelse af nukleinsyre.

Inhibering af polymeraseaktivitet under amplifikation

Generelt bruges inhibering som et containerkoncept til at beskrive alle faktorer, der fører til suboptimale PCR -resultater. I en strengt biokemisk forstand er inhibering begrænset til aktiviteten af ​​enzymet, dvs. det reducerer eller forhindrer underlagsproduktkonvertering gennem interaktion med det aktive sted for DNA-polymerasen eller dets cofaktor (f.eks. Mg2+ for TAQ DNA-polymerase).
Komponenter i prøven eller forskellige buffere og ekstrakter indeholdende reagenser kan direkte hæmme enzymet eller fange dets cofaktorer (f.eks. EDTA), hvilket inaktiverer polymerasen og fører til gengæld til nedsatte eller falske negative PCR -resultater.
Imidlertid betegnes mange interaktioner mellem reaktionskomponenter og målholdige nukleinsyrer også som 'PCR-hæmmere'. Når cellens integritet er afbrudt af isolering, og nukleinsyren frigives, kan interaktioner mellem prøven og dens omgivende opløsning og fast fase forekomme. F.eks. Kan 'scavengers' binde enkelt- eller dobbeltstrenget DNA gennem ikke-kovalente interaktioner og forstyrre isolering og oprensning ved at reducere antallet af mål, der til sidst når PCR-reaktionsbeholderen.
Generelt er PCR -hæmmere til stede i de fleste kropsvæsker og reagenser, der bruges til kliniske diagnostiske tests (urinstof i urin, hæmoglobin og heparin i blod), kosttilskud (organiske komponenter, glycogen, fedt, Ca2+ -ioner) og komponenter i miljøet (fenoler, tunge metaller)

Flere udbredte PCR-hæmmere findes i bakterier og eukaryote celler, ikke-mål-DNA, DNA-bindende makromolekyler af vævsmatrixer og laboratorieudstyr såsom handsker og plast. Oprensning af nukleinsyrer under eller efter ekstraktion er den foretrukne metode til fjernelse af PCR -hæmmere.
I dag kan forskellige automatiserede ekstraktionsudstyr erstatte mange manuelle protokoller, men 100% gendannelse og/eller oprensning af mål er aldrig opnået. Potentielle hæmmere kan stadig være til stede i de oprensede nukleinsyrer eller måske allerede har truffet virkning. Der findes forskellige strategier for at reducere virkningen af ​​hæmmere. Valget af den passende polymerase kan have en betydelig indflydelse på inhibitoraktivitet. Andre påviste metoder til at reducere PCR -hæmning øger polymerasekoncentrationen eller påfører additiver såsom BSA.
Inhibering af PCR -reaktioner kan demonstreres ved anvendelse af intern proceskvalitetskontrol (IPC).
Der skal udvises omhu for at fjerne alle reagenser og andre opløsninger i ekstraktionssættet, såsom ethanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol og phenol, fra nukleinsyreisolatet med et grundigt vasketrin. Afhængig af deres koncentration kan de aktivere eller hæmme PCR.