Ydeevne af fire nukleinsyreforstærkningsassays for at identificere SARS-CoV-2 i Etiopien

Tak fordi du besøgte Nature.com. Du bruger en browserversion med begrænset CSS -support. For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). For at sikre løbende støtte viser vi desuden stedet uden stilarter og JavaScript.
Viser en karrusel med tre lysbilleder på én gang. Brug de foregående og næste knapper til at bevæge sig gennem tre lysbilleder ad gangen, eller brug skyderens knapper i slutningen til at bevæge sig gennem tre lysbilleder ad gangen.
Siden Coronavirus-sygdommen i 2019 (Covid-19) er der udviklet mange kommercielle nukleinsyreforstærkninger (NAATS) over hele verden og er blevet standardassays. Selvom flere tests hurtigt blev udviklet og anvendt til laboratoriediagnostiske tests, er ydelsen af ​​disse test ikke blevet evalueret i en række forskellige indstillinger. Derfor havde denne undersøgelse til formål at evaluere ydelsen af ​​Abbott SARS-COV-2, Daan-genet, BGI og sansure biotek-assays ved hjælp af den sammensatte referencestandard (CRS). Undersøgelsen blev udført ved det etiopiske offentlige sundhedsinstitut (EPHI) fra 1 til 30. december 2020. 164 Nasopharyngeal -prøver blev ekstraheret under anvendelse af QIAAMP RNA Mini Kit og Abbott DNA -prøvepræparatsystemet. Af 164 prøver var 59,1% positive og 40,9% var negative for CRS. Sansure Biotech -positivitet var signifikant lav sammenlignet med CRS (P <0,05). Sansure Biotech -positivitet var signifikant lav sammenlignet med CRS (P <0,05). Положителные резттаты sansure biotech ыи значително ниже по сравнению с crs (p <0,05). Sansure Biotechs positive resultater var signifikant lavere sammenlignet med CRS (P <0,05).与 CRS 相比 ， sansur Biotech 的阳性率显着较低（ P <0,05）。与 CRS 相比 ， sansur Biotech 的阳性率显着较低（ P <0,05）。 У sansure biotech ыоо значително менше положителных резттатов по сравнению с crs (p <0,05). Sansure Biotech havde signifikant færre positive resultater sammenlignet med CRS (P <0,05).Den samlede aftale med de fire analyser var 96,3–100% sammenlignet med CRS. Ud over den lave positivitetsgrad for Sansure Biotech -assayet var ydelsen af ​​de fire assays næsten sammenlignelig. Som sådan kræver Sansure Biotech [kun forskning (RUO)] -assay yderligere validering til dens anvendelse i Etiopien. Endelig bør yderligere forskning overvejes for at evaluere assays med passende producentens påstande.
Laboratorietest er en del af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) strategisk plan for coronavirus sygdom 2019 (Covid-19) beredskab og respons (SPRP). Der rådgiver, at lande er nødt til at opbygge laboratoriekapacitet til at forbedre beredskabet, korrekt sagsbehandling, årvågenhed og hurtig reaktion på folkesundhedsudfordringer. Dette antyder, at laboratoriets rolle er nøglen til at karakterisere sygdommen og epidemiologien af ​​nye infektiøse midler og kontrollere deres spredning.
Diagnosen af ​​Covid-19 kræver epidemiologisk og medicinsk information, personlige symptomer/tegn og radiografiske og laboratoriedata2. Siden COVID-19-udbruddet blev rapporteret i Wuhan, Kina, er der udviklet mange kommercielle nukleinsyreforstærker (NAATS) over hele verden. Real-time omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion (RRT-PCR) er blevet anvendt som en rutinemæssig og standardmetode til laboratoriediagnose af alvorligt akut respiratorisk syndrom 2 (SARS-CoV-2) 3-infektion. Molekylær påvisning af SARS-COV-2 er typisk baseret på N (nucleocapsid proteingen), E (konvolutproteingen) og RDRP (RNA-afhængig RNA-polymerasegen) gener i ORF1A/B (åben læseramme 1A/B). gen) region identificeret fra det virale genom. De betragtes som de vigtigste konserverede regioner, der findes i virale genomer til virusgenkendelse4. Blandt disse gener har RDRP- og E -generne høj analytisk detektionsfølsomhed, mens N -genet har lav analytisk følsomhed5.
Ydelsen af ​​PCR -assays kan variere afhængigt af forskellige faktorer, såsom: ekstraktionsreagenser, amplifikations-/detektionsreagenser, ekstraktionsmetode, kvaliteten af ​​PCR -maskinen og andre instrumenter. Fra april 2020 har mere end 48 forskellige diagnostiske enheder fra ni lande modtaget tilladelse til nødbrug (EUA) for Diagnostics Covid-196. I Etiopien bruges mere end 14 PCR-platforme i realtid til PCR-detektion af SARS-CoV-2 på 26 offentlige sundhedsinstitutioner, herunder ABI 7500, Abbott M2000, Roche 48000 og Quant-Studio7. Derudover er forskellige PCR-testsæt tilgængelige, såsom DAAN-genetest, Abbott SARS-COV-2-test, sansur Biotech-test og SARS-COV-2 BGI-test. Selvom RRT-PCR er meget følsom, rapporterer nogle patienter med COVID-19 falske negative resultater på grund af utilstrækkelige kopier af viral ribonukleinsyre (RNA) i prøver på grund af forkert opsamling, transport, opbevaring og håndtering og laboratorietest. Betingelser og handlinger fra personale8. Derudover kan prøve- eller kontrol-fejlbehagning, cyklusgrænse (CT) -indstilling og krydsreaktivitet med andre patogene nukleinsyrer eller inaktive/resterende SARS-CoV-2 RNA føre til falske positive resultater i RRT-PCR9-assays. Det er således klart, at PCR -test faktisk kan identificere bærere af genfragmenter, da de ikke engang kan skelne mellem virkelig aktive virale gener, så testene kun kan identificere bærere og ikke patienter10. Derfor er det vigtigt at vurdere diagnostisk ydeevne ved hjælp af standardmetoder i vores indstilling. Selvom mange NAAT -reagenser er tilgængelige ved det etiopiske offentlige sundhedsinstitut (EPHI) og i hele landet, er der endnu ikke rapporteret om nogen sammenlignende evaluering af deres effektivitet. Derfor havde denne undersøgelse til formål at evaluere den sammenlignende ydeevne af kommercielt tilgængelige sæt til påvisning af SARS-COV-2 ved RRT-PCR ved anvendelse af kliniske prøver.
I alt 164 deltagere med mistanke om COVID-19 blev inkluderet i denne undersøgelse. Størstedelen af ​​prøver var fra behandlingscentre (118/164 = 72%), mens de resterende 46 (28%) deltagere var fra ikke-behandlingscentre. Blandt deltagere, der ikke blev behandlet i centret, havde 15 (9,1%) klinisk mistanke om sager, og 31 (18,9%) havde kontakter med bekræftede sager. Deltagere på treoghalvfems (56,7%) var mandlige, og den gennemsnitlige (± SD) alder for deltagerne var 31,10 (± 11,82) år.
I denne undersøgelse blev positive og negative hastigheder på fire tests for Covid-19 bestemt. Således var de positive hastigheder for Abbott SARS-COV-2-assayet, Daan-genet 2019-NCOV-assay, SARS-CoV-2 BGI-assay og sansur Biotech 2019-NCOV-assay henholdsvis 59,1%, 58,5%, 57,9% og 55,5%. Den positive og negative sammensatte referencestandard (CRS) score var henholdsvis 97 (59,1%) og 67 (40,9%) (tabel 1). I denne undersøgelse var definitionen af ​​CRS baseret på den "enhver positive" regel, hvorved af fire testresultater blev to eller flere testresultater, der gav det samme resultat, betragtet som sandt positivt eller negativt.
I denne undersøgelse fandt vi en negativ procentvis aftale (NPA) på 100% (95% CI 94,6–100) for alle analyser sammenlignet med CRS. Sansure Biotechnology-analysen viste en minimal PPA på 93,8% (95% CI 87,2-97,1), og DAAN-genet 2019-NCOV-analysen havde en samlet aftale på 99,4% (95% CI 96,6-99,9). I modsætning hertil var den samlede aftale mellem SARS-CoV-2 BGI-assayet og Sansure Biotech 2019-NCOV-assayet henholdsvis 98,8% og 96,3% (tabel 2).
Cohens kappa-koefficient for enighed mellem CRS og Abbott SARS-COV-2-assayresultater var fuldt konsistent (K = 1,00). Tilsvarende er Cohens Kappa-værdier, der er påvist af Daan Gene 2019-NCOV, SARS-CoV-2 BGI og Sansure Biotech 2019-NCOV, også fuldt ud i overensstemmelse med CRS (K ≥ 0,925). I denne komparative analyse viste CHI-square-testen (McNemar-test), at Sansure Biotech 2019-NCOV-assayresultaterne var signifikant forskellige fra CRS-resultaterne (P = 0,031) (tabel 2).
Som vist i fig.1 Procentdelen af ​​den laveste CT-værdi (<20 CT) af Abbott SARS-CoV-2-assay (kombineret RDRP og N-gen) var 87,6% og ORF1A/B-gen CT-værdien af ​​sansure Biotech 2019-NCOV-assay viste, at procentdelen af ​​lav CT-værdi (<20 CT) var 50,3% og høj CT-værdi (36-40 CT) var 3,2%. 1 Procentdelen af ​​den laveste CT-værdi (<20 CT) af Abbott SARS-CoV-2-assay (kombineret RDRP og N-gen) var 87,6% og ORF1A/B-gen CT-værdien af ​​sansure Biotech 2019-NCOV-assay viste, at procentdelen af ​​lav CT-værdi (<20 CT) var 50,3% og høj CT-værdi (36-40 CT) var 3,2%.Som vist i fig.1, процент наименшего значениindes ct (<20 ct) анализа Abbott Sars-CoV-2 (коминирykke ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значение Ct (36–40 Ct) составл fe 3,2%. 1, the percentage of the lowest Ct value (< 20 Ct) analysis of Abbott SARS-CoV-2 (combined gene RdRp and N) was 87.6%, and the Ct value of ORF1a/b gene analysis of Sansure Biotech 2019-nCoV showed that the percentage of low Ct value (< 20 Ct) accounted for 50.3%, and high value Ct (36–40 Ct) accounted for 3,2%.如图 1 所示 ， Abbott SARS-COV-2 检测（结合 RDRP 和 N 基因） 的最低 CT 值百分比（ <20 CT） 为 87,6%， sansur Biotech 2019-NCOV 检测的 ORF1A/B 基因 CT 值显示低 CT 值 (<20 CT) 的百分比为 50,3%， 高 CT 值 (36-40 CT) 的百分比为 3,2%。。。 值 值 高 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 检测的 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 为 的最低 的最低 的最低 的最低 的最低 的最低 的最低 As shown in Figure 1, the lowest Ct value percentage (< 20 Ct) of Abbott SARS-CoV-2 test (combination of RdRp and N gene) is 87.6%, the ORF1a/b gene Ct value of Sansure Biotech 2019-nCoV test shows low Ct值(< 20 Ct) 的 percentage is 50.3%, 高Ct 值(36–40 Ct) 的 percentage is 3,2%. Как показано на риснке 1, аниз Abbott Sars-CoV-2 (сочетающий гены rdrp и n) имел сое низое процентное зykke и с н edet) разере 87,6%, аначение ct гена orf1a/b и и и и и и и и и иf1a/b и и и и н н н н н н edet Som vist i figur 1 havde Abbott SARS-COV-2-assayet (kombineret RDRP og N-gener) den laveste procentdel CT-værdi (<20 CT) ved 87,6%, mens CT-værdien af ​​ORF1A/B-genet i Sansure Biotech 2019-undersøgelsen-analysen af ​​NCOV viste en lav CT. Процент значений (<20 ct) составил 50,3%, ароцент выоких значений CT (36–40 ct) составил 3,2%. Procentdelen af ​​værdier (<20 CT) var 50,3%, og procentdelen af ​​høje CT -værdier (36–40 CT) var 3,2%.Abbott SARS-CoV-2 B-test registrerede CT-værdier over 30. På den anden side var på BGI SARS-COV-2-assay ORF1A/B-genet en høj CT-værdi (> 36 CT) -procent var 4% (fig. 1). På den anden side var på BGI SARS-COV-2-assay ORF1A/B-genet en høj CT-værdi (> 36 CT) -procent var 4% (fig. 1). С друой стороны, анализе Bgi Sars-CoV-2 ген orf1a/b имел Выыое значение CT (> 36 ct), процент коykke På den anden side i analysen af ​​BGI SARS-CoV-2-genet ORF1a/B havde en høj CT-værdi (> 36 CT), hvis procentdel var 4% (fig. 1).另一方面 ， 在 BGI SARS-CoV-2 检测中 ， Orf1a/B 基因具有高 CT 值（> 36 CT） 的百分比为 4%（图 1）。 På den anden side i BGI SARS-COV-2-detektion er procentdelen af ​​ORF1a/B-genet med høj CT-værdi (> 36 CT) 4% (figur 1). С друой стороны, анализе Bgi Sars-CoV-2 процент генов Orf1a/B с выокимначениsdag Ct (> 36 ct) состаил 4% (рис. 1). På den anden side i BGI SARS-COV-2-analysen var procentdelen af ​​ORF1a/B-gener med høje CT-værdier (> 36 CT) 4% (fig. 1).
I denne undersøgelse tog vi 164 nasopharyngeal prøver. For alle typer assays blev RNA -isolering og amplifikation udført under anvendelse af de metoder og sæt anbefalet af de respektive producenter.
Denne undersøgelse demonstrerede, at Abbott's test for SARS-COV-2 har den samme detektionsydelse som CRS, med 100% positiv, negativ og generel konkordance. Cohens Kappa -aftale er 1,00, hvilket indikerer fuld overensstemmelse med CRS. En lignende undersøgelse fra University of Washington i USA fandt, at den samlede følsomhed og specificitet af Abbott-testen for SARS-CoV-2 var henholdsvis 93% og 100% sammenlignet med den laboratoriebestemte assay (LDA) af CDC. 11. Abbott SARS-COV-2-detektionssystemet er baseret på den samtidige kombinerede detektion af N- og RDRP-generne, da begge gener er mere følsomme, hvilket minimerer falske negativer12. En undersøgelse i Wien, Østrig viste også, at store ekstraktionsprøvevolumener og detektion af eluerende volumener minimerede fortyndingseffekter og øget detektionseffektivitet13. Således kan Abbott's perfekte match til SARS-COV-2-assayet være forbundet med et platformdetektionssystem, der samtidig registrerer kombinatoriske gener, udtrækker et stort antal prøver (0,5 ml) og bruger en stor mængde eluent (40 µl).
Vores resultater viste også, at detektionsydelsen af ​​DAAN -genetisk test var næsten den samme som for CRS. Dette er i overensstemmelse med en undersøgelse14 udført ved Anhui University i Huainan, Kina og producentens påstand om 100% positiv aftale. På trods af rapporter om konsistente resultater var en prøve falsk negativ efter at have genprøvet den samme eluat, men var positiv i Abbott SARS-CoV-2 og sansur Biotech NCOV-2019-assays. Dette antyder, at der kan være variation i resultater på tværs af forskellige typer assays. Ikke desto mindre, i undersøgelsen udført i Kina15, var resultatet af DAAN-genassayet signifikant forskelligt (P <0,05) sammenlignet med deres lab-definerede referencestrømmelsesassay. Ikke desto mindre, i undersøgelsen udført i Kina15, var resultatet af DAAN-genassayet signifikant forskelligt (P <0,05) sammenlignet med deres lab-definerede referencestrømmelsesassay. Н н н н и и и и и и и иedet, иедедовании, провomm лабораторно lide эталонноgå ааниза. I en undersøgelse i Kina15 var DAAN -genets analyseresultat imidlertid signifikant forskellig (P <0,05) fra deres laboratoriereferencanalyse.然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（ p <0,05）。然而 ， 在中国进行的研究中 15 ， 大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差 <0,05 Однако иседованииskyld, проведенном витance15, резттаты геedel сравнению с эталонны лабораторны тестом. I en undersøgelse i Kina15 var resultaterne af Daans genetiske test imidlertid signifikant forskellige (p <0,05) sammenlignet med dens referencelaboratorietest.Denne uoverensstemmelse kan skyldes følsomheden af ​​referencetesten til at detektere SARS-CoV-2, og yderligere undersøgelser kan være vigtige for at bestemme årsagen.
Derudover evaluerede vores undersøgelse den komparative ydelse af SARS-CoV-2 BGI-assayet med CRS, der viste fremragende positiv procentvisaftale (PPA = 97,9%), negativ procentvis aftale (NPA = 100%) og den samlede procentvise aftale efter køn (OPA). ). = 98,8%). Cohens kappa -værdier viste god enighed (k = 0,975). Undersøgelser i Holland16 og Kina15 har vist ensartede resultater. SARS-COV-2 BGI-testen er et enkelt gen (ORF1A/B) detektionstest ved anvendelse af 10 µl amplifikation/detektion eluat. På trods af god statistisk aftale med vores referencesultater gik analysen glip af to positive prøver (1,22%) af den samlede prøve. Dette kan have enorme kliniske implikationer for transmissionsdynamik på både patient- og samfundsniveauer.
En anden komparativ analyse inkluderet i denne undersøgelse var Sansure Biotech NCOV-2019 RRT-PCR (RUO) assay; Den samlede matchprocent var 96,3%. Styrken af ​​aftalen blev også bestemt af Cohens kappa -værdi, som var 0,925, hvilket indikerede fuld overensstemmelse med CRS. Igen er vores resultater identiske med undersøgelser udført ved Central South University i Changsha, Kina og på det kliniske laboratorieafdeling i Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, Kina17. Selvom ovennævnte gode statistiske overensstemmelser blev registreret, viste chi-square-testen (MacNemar-testen), at resultatet af sansure-biotek-assayet har haft en statistisk signifikant forskel sammenlignet med CRS (p <0,005). Selvom ovennævnte gode statistiske overensstemmelser blev registreret, viste chi-square-testen (MacNemar-testen), at resultatet af sansure-biotek-assayet har haft en statistisk signifikant forskel sammenlignet med CRS (p <0,005). Несотр egen то, что ыоо ззикирykke (криdredeрomm 0,005). Selvom den gode statistiske aftale ovenfor blev registreret, viste chi-square-testen (McNemar-testen), at resultatet af Sansure Biotech-assayet havde en statistisk signifikant forskel sammenlignet med CRS (P <0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性 ， 但卡方检验（ Macnemar 检验） 表明 ， sansur Biotech 检测的结果与 CRS 相比具有统计学显着差异（ P <0,005）。尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性. Несотkelig на отмеченное выше хороше статистичесое сотвomm статистич egen På trods af den gode statistiske aftale, der er nævnt ovenfor, viste chi-square-testen (McNemar-testen) en statistisk signifikant forskel (p <0,005) mellem sansuren biotek-assay og CRS.Seks prøver (3,66%) viste sig at være falske negativer sammenlignet med CRS (supplerende tabel 1); Dette er meget vigtigt, især i betragtning af dynamikken i transmission af virussen. Ovenstående data understøtter også denne lave detektionshastighed15.
I denne undersøgelse blev CT-værdier bestemt for hver assay og respektive platform med den laveste gennemsnitlige CT-værdi rapporteret i Abbott SARS-CoV-2-assayet. Dette resultat kan være relateret til Abbotts samtidige kombinerede genetiske testsystem til påvisning af SARS-CoV-2. I henhold til figur 1 havde 87,6% af Abbott SARS-COV-2-resultaterne CT-værdier under 20 år. Kun et lille antal prøveresultater (12,4%) var i området 20-30. CT -værdier over 30 blev ikke registreret. Foruden Abbott's brug af SARS-COV-2-panelgenetisk testformat kan dette resultat være relateret til den nedre detektionsgrænse (32,5 RNA-kopier/ml) 18, som er tre gange lavere end selskabets lavere grænse på 100 RNA-kopier/ml. ml) 19.
Denne undersøgelse har nogle begrænsninger: For det første har vi ikke standard/referencemetoder [såsom viral belastning eller andre laboratorieundersøgelser (LDA)] på grund af manglende ressourcer. For det andet var alle prøver, der blev anvendt i denne undersøgelse, nasopharyngeal vatpinde, mens resultaterne ikke var anvendelige til andre eksempler på, og for det tredje var vores prøvestørrelse lille.
Denne undersøgelse sammenlignede ydelsen af ​​fire RRT-PCR-assays for SARS-COV-2 under anvendelse af nasopharyngeal prøver. Alle detektionsassays havde næsten sammenlignelig ydelse, med undtagelse af Sansure Biotech -assayet. Desuden blev den lave positivitetshastighed identificeret i Sansure Biotech -assayet sammenlignet med CRS (P <0,05). Desuden blev den lave positivitetshastighed identificeret i Sansure Biotech -assayet sammenlignet med CRS (P <0,05). Кроме того, тесте sansure Biotech ыы Вы ыance низий прцент полителных резтатов по сравнению с crs (p <0,05). Derudover viste Sansure Biotech -testen en lav procentdel af positive resultater sammenlignet med CRS (P <0,05).此外 ， 与 CRS 相比 ， sansur Biotech 检测的阳性率较低 (p <0,05)。此外 ， 与 CRS 相比 ， sansur Biotech 检测的阳性率较低 (p <0,05)。 Кроме того, аанализ sansure biotech имел боле низий у у п п нedet н не н н н п н н edet н н н н н edet н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н edet н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н н edet н н н н н н н н н н н н н р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р. Derudover havde Sansure Biotech -assayet en lavere positivitetsrate sammenlignet med CRS (P <0,05).Den sansure bioteknologiske NCOV-2019 (RUO) analyse af PPA, NPA og den samlede aftale oversteg 93,5% med en Cohen Kappa-styrke af en aftaleværdi på 0,925. Endelig har Sansure Biotech Assay (RUO) brug for yderligere validering til brug i Etiopien, og yderligere forskning bør overvejes for at evaluere krav fra individuelle producenter.
Sammenlignende undersøgelsesdesign blev udført på fire sundhedsfaciliteter i Addis Abeba, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Center, Zewooditu Memorial Hospital og St. Peters tuberkulosespecialist Hospital. Dataene blev indsamlet mellem 1. og 31. december 2020. De medicinske faciliteter til denne undersøgelse blev målrettet valgt baseret på deres høje antal tilfælde og tilgængeligheden af ​​større behandlingscentre i byen. Tilsvarende blev instrumenter, inklusive ABI 7500 og Abbott M2000 realtid PCR-instrumenter, valgt i henhold til anbefalingerne fra NAAT-reagensproducenterne, og fire PCR-detektionssæt blev valgt til denne undersøgelse, da de fleste laboratorier i Etiopien anvendte mindst mindst fire af dem. Genetest, Abbott SARS-COV-2-test, sansur Biotech-test og SARS-CoV-2 BGI-test udført under undersøgelsen).
Testning for SARS-COV-2 blev udført fra 1. til 30. december 2020 under anvendelse af 3 ml viralt transportmedium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) fra personer, der blev undersøgt for Covid-19, henvist til EPHI. Nasopharyngeal -prøver blev opsamlet af trænede prøveopsamlere og sendt til EPHI i tredobbelt pakker. Før nukleinsyreisolering tildeles hver prøve et unikt identifikationsnummer. Ekstraktion udføres fra hver prøve umiddelbart ved ankomst ved hjælp af manuelle og automatiske ekstraktionsmetoder. For den automatiske ekstraktion af Abbott M2000 blev 1,3 ml (inklusive 0,8 ml dødvolumen og 0,5 ml ekstraktionsindgangsvolumen) af prøven ekstraheret fra hver prøve og passeret gennem Abbott DNA -prøvepræparatsystemet (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). ) En batch på 96 [92 prøver, to detektionskontroller og to ikke-skæv kontroller (NTC)] blev inkluderet i den overordnede proces (hentning og detektion) af to runder med SARS-CoV-2 (EUA) i realtid. minedrift. Tilsvarende skal du bruge de samme prøver (til automatisk ekstraktion og opdagelse). I under hele processen blev 140 µl prøver alikvoteret og ekstraheret under anvendelse af Qiaamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) i batches på 24 (inklusive 20 prøver, to assayrontroller og to NTC'er) over ni runder. Manuelt ekstraherede eluater blev amplificeret og detekteret under anvendelse af en ABI 7500 termisk cycler under anvendelse af SARS-CoV-2 BGI-assay, DAAN-genassay og sansure biotek-assay.
Automatiseret isolering og oprensning af SARS-COV-2 viralt RNA følger det magnetiske perleprincip ved anvendelse af Abbott DNA-prøvepræparatreagenser. Inaktivering af prøver og solubilisering af virale partikler udføres under anvendelse af et vaskemiddel indeholdende guanidin -isothiocyanat til at denaturere proteinet og inaktivere RNase. RNA adskilles derefter fra proteinet ved fast faseseparation under anvendelse af silica, dvs. Guanidiniumsalt og den alkaliske pH i lyseringsbufferen fremmer binding af nukleinsyrerne til silica (SiO2). Skylningstrinnet fjerner resterende proteiner og affald for at producere en klar opløsning. Gennemsigtig RNA isoleres fra silica-baserede mikropartikler ved hjælp af instrumentets magnetfelt20,21. På den anden side udføres manuel isolering og oprensning af RNA ved hjælp af spin -søjle -metoden ved anvendelse af centrifugering i stedet for et magnetisk stativ og adskillelse af mikropartikler fra elueringsmidlet.
Abbott Real-Time SARS-COV-2-detektionstest (Abbott Molecular, Inc.) blev udført i henhold til producentens instruktioner, der modtog EUA19,22 fra WHO og FDA. I denne protokol blev prøveinaktivering før ekstraktion udført i et vandbad ved 56 ° C i 30 minutter. Efter virusinaktivering blev nukleinsyreekstraktion udført på et Abbott M2000 SP -instrument fra 0,5 ml VTM under anvendelse af et Abbott M2000 DNA -prøvepræparatsystem. Ifølge producenten. Amplifikation og detektion blev udført under anvendelse af et Abbott M2000 RT-PCR-instrument, og dobbeltdetektion blev udført for RDRP- og N-generne. ROX) og VIC P (proprietært farvestof) til målretning og påvisning af intern kontrol, hvilket tillader samtidig detektion af begge amplifikationsprodukter 19.
Forstærkningsdetekteringsmetoden for dette kit er baseret på et-trin RT-PCR-teknologi. ORF1A/B- og N -generne blev valgt som konserverede regioner ved Daan -geneteknologi til at detektere målområde -amplifikation. Specifikke primere og fluorescerende prober (N-genprober mærket med FAM, ORF1A/B-prober mærket med VIC) er designet til at detektere SARS-CoV-2 RNA i prøver. De endelige elueringsmiddel- og masterblandinger blev fremstillet ved at tilsætte 5 µl elueringsmiddel til 20 ul af masterblandingen til et slutvolumen på 25 µl. Amplifikation og detektion blev udført samtidig på et ABI 750024 realtid PCR-instrument.
ORF1A/B- og N-generne blev påvist under anvendelse af Sansure Biotech NCOV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluorescerende PCR-detektion). Forbered specifikke sonder for hvert målgen ved at vælge FAM -kanalen til ORF1A/B -regionen og Rox -kanalen for N -genet. Til dette assay -kit tilsættes eluent- og masterblandingsreagenser som følger: Forbered 30 µl master mixreagens og 20 ul elueret prøve til detektion/amplifikation. PCR ABI 750025 i realtid blev anvendt til amplifikation/detektion.
SARS-CoV-2 BGI-testen er en fluorescerende realtid RRT-PCR-kit til diagnose af Covid-19. Målregionen er placeret i ORF1A/B-regionen af ​​SARS-COV-2-genomet, som er en enkelt gendetektionsmetode. Derudover er det humane husholdningsgen-ß-actin et internt reguleret målgen. Masterblandingen fremstilles ved at blande 20 µl af masterblandingsreagenset og 10 µl af den ekstraherede RNA -prøve i en brøndplade26. Et ABI 7500 fluorescerende kvantitativt PCR-instrument i realtid blev anvendt til amplifikation og detektion. Al nukleinsyreforstærkning, PCR -kørselsforhold for hvert assay og fortolkning af resultater blev udført i henhold til den respektive producentens instruktioner (tabel 3).
I denne komparative analyse brugte vi ikke referencestandardmetoden til at bestemme procentdel (positiv, negativ og generelt) og andre sammenligningsparametre for de fire analyser. Hver testsammenligning blev foretaget med CRS, i denne undersøgelse blev CRS fastlagt ved reglen "enhver positiv", og resultatet blev bestemt, ikke ved en enkelt test, vi brugte mindst to matchede testresultater. I tilfælde af covid-19 transmission er falske negative resultater mere farlige end falske positive resultater. For at sige ”positivt” så nøjagtigt som muligt fra et CRS -resultat, skal mindst to assaytest være positive, hvilket betyder, at mindst et positivt resultat sandsynligvis kommer fra en EUA -assay. Ud af fire testresultater betragtes således to eller flere testresultater, der giver det samme resultat, sande positive eller negative18,27.
Data blev indsamlet ved hjælp af strukturerede dataekstraktionsformularer, dataindtastning og analyse blev udført ved hjælp af Excel Statistical Software og SPSS version 23.0 til beskrivende statistik. Positive, negative og samlede procentvise aftale blev analyseret, og en Kappa -score blev anvendt til at bestemme graden af ​​aftale for hver metode med CRS. Kappa-værdier fortolkes som følger: 0,01 til 0,20 for mild aftale, 0,21 til 0,40 for generel aftale, 0,41-0,60 for moderat aftale, 0,61-0,80 for større aftale og 0,81-0,99 for komplet aftale28.
Etisk clearance blev opnået fra University of Addis Abeba, og alle eksperimentelle protokoller til denne undersøgelse blev godkendt af det etiopiske offentlige sundhedsinstituts videnskabelige etiske gennemgangsbestyrelse. Referencenummeret for EPHI-etiklicensen er EPHI/IRB-279-2020. Alle metoder blev anvendt i overensstemmelse med anbefalingerne og bestemmelserne i de etiopiske nationale omfattende retningslinjer for behandling af Covid-19. Derudover blev skriftligt informeret samtykke opnået fra alle undersøgelsesdeltagere inden deltagelse i undersøgelsen.
Alle data opnået eller analyseret i denne undersøgelse er inkluderet i denne offentliggjorte artikel. Data, der understøtter resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den respektive forfatter efter rimelig anmodning.
Verdenssundhedsorganisationen. Anbefalinger til laboratorieteststrategier for Covid-19: Interim vejledning, 21. marts 2020 Nr. WHO/2019-NCOV/LAB_TESTING/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, Ki Covid-19 Smart diagnose i akuttafdelingen: All-in i praksis. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, Ki Covid-19 Smart diagnose i akuttafdelingen: All-in i praksis.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. og Gurgulianis, Ki Intelligent Diagnose af Covid-19 i akuttafdelingen: alt i praksis.Muliou DS, Pantazopoulos I. og Gurgulyanis Ki Intelligent diagnose af Covid-19 i akutafdelinger: End-to-End-integration i praksis. Ekspert pastor respir. medicin. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Evaluering af Covid19 ID nu EUA Assay. Mitchell, SL & St George, K. Evaluering af Covid19 ID nu EUA Assay.Mitchell, SL og St. George, K. Evaluering af Covid19 ID nu EUA -assay.Mitchell SL og St. George K. Evaluering af Covid19 ID nu EUA -assay. J. Klinisk. Virus. 128, 104429. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratoriedetektion af coronavirus sygdom 2019 (Covid-19) ved mistanke om menneskelig sygdom. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (adgang 15. august 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al. Covid-19 Diagnose: Sygdomme og testværktøjer. ACS Nano 14 (4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Oprettelse af College of Pathologs of Eastern, Central and Southern Africa - Regional School of Pathology of the Mellemøsten og Sydafrika. Afrika. J. Lab. medicin. 9 (1), 1-8 (2020).
Etiopisk Institute of Public Health, føderalt sundhedsministerium. Interim national strategi og vejledning til laboratoriediagnose af Covid-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/ephi_pheoc_covid-19_laboratory_diagnosis_eng.pdf (adgang 12. august 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, som falske negative tests for SARS-CoV-2-infektionsudfordringer og implikationer. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, som falske negative tests for SARS-CoV-2-infektionsudfordringer og implikationer.Voloshin S., Patel N. og Kesselheim som falske-negative tests for SARS-CoV-2-infektioner og deres konsekvenser.Voloshin S., Patel N. og Kesselheim som falsk-negative tests for provokation og virkningen af ​​SARS-CoV-2-infektion. N. Eng. J. Medicin. 383 (6), E38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, Ki False-Positive og False-Negative Covid-19 tilfælde: åndedrætsværn og styringsstrategier, vaccination og yderligere perspektiver. Mouliou, DS & Gourgoulianis, Ki False-Positive og False-Negative Covid-19 tilfælde: åndedrætsværn og styringsstrategier, vaccination og yderligere perspektiver. Mouliou, Ds & gourgoulianis, ki ложноположителные и ложнотрицателные саи covid-19: раиррykke лечениkald, Вацинацин и и иалнейшие персеектиåbe. Mouliou, DS & Gourgoulianis, Ki falske positive og falske negative tilfælde af Covid-19: åndedrætsstrategier og behandlingsstrategier, vaccination og vejen frem.Muliu, DS og Gurgulianis, Ki False-Positive og False-Negative tilfælde af Covid-19: Strategier til respiratorisk forebyggelse og behandling, vaccination og vejen frem. Ekspert pastor respir. medicin. 15 (8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Covid-19-diagnose i akuttafdelingen: at se træet men miste skoven. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Covid-19-diagnose i akuttafdelingen: at se træet men miste skoven.Mouliou, DS, Ioannis, P. og Konstantinos, G. Covid-19-diagnose i akuttafdelingen: se træet, mister skoven.Muliou DS, Ioannis P. og Konstantinos G. Covid-19-diagnose i akuttrum: ikke nok skov til træerne. Vises. medicin. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validering og validering af den analytiske og kliniske ydeevne af Abbott Realtime SARS-CoV-2-assay. J. Klinisk. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning Fem primersæt fra forskellige genomregionen af ​​Covid-19 til påvisning af virusinfektion ved konventionel RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning af fem primersæt fra forskellige genomregioner af Covid-19 til påvisning af virusinfektion med konventionel RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. og Aflatunyan, B. Sammenligning af fem sæt primere fra forskellige regioner af covid-19-genomet til påvisning af viral infektion med konventionel RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自 Covid-19 不同基因组区域的五个引物组 ， 用于通过常规 RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Nneestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning af 5 forskellige genetiske regioner af Covid-19 til påvisning af virusinfektion ved konventionel RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. og Aflatunyan B. Sammenligning af fem sæt primere fra forskellige regioner i covid-19-genomet til påvisning af viral infektion ved konventionel RT-PCR.Iran. J. Mikrobiologi. 12 (3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Foreløbige resultater af det nationale eksterne kvalitetsvurderingsprogram til påvisning af SARS-CoV-2-genomsekvenser. J. Klinisk. Virus. 129, 104537. Https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Analytisk evaluering af effektiviteten af ​​fem RT-PCR-sæt til svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2. J. Clinical. laboratorium. anus. 35 (1), E23643 (2021).
Wang B. et al. Evaluering af syv kommercielt tilgængelige SARS-COV-2 RNA-detektionssæt i Kina baseret på realtids polymerasekædereaktion (PCR). klinisk. Kemisk. laboratorium. medicin. 58 (9), E149 - E153 (2020).
Van Casteren, PB et al. Sammenligning af syv kommercielle RT-PCR COVID-19 diagnostiske sæt. J. Klinisk. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Sammenligning af diagnostisk ydeevne af to PCR-sæt til påvisning af SARS-CoV-2 nukleinsyrer. J. Klinisk. laboratorium. anus. 34 (10), E23554 (2020).
Lefart, PR osv. En komparativ undersøgelse af fire SARS-COV-2 nukleinsyreforstærkningstest (NAAT) platforme viste, at ID nu var ydelsen signifikant nedbrudt afhængigt af patient- og prøvetype. diagnose. Mikrobiologi. Inficere. diss. 99 (1), 115200 (2021).
Abbott -molekyle. Abbott Real-Time SARS-COV-2-analysepakkeindsats. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/realtime-sars-cov-2-assay. 1-12. (Pr. 10. august 2020) (2020).
Klein, S. et al. SARS-CoV-2 RNA-isolering ved anvendelse af magnetiske perler til hurtig storskala detektion med RT-qPCR og RT-lamp. Virus 12 (8), 863 (2020).