Udførelse af fire nukleinsyreamplifikationsassays for at identificere SARS-CoV-2 i Etiopien

Tak fordi du besøgte Nature.com. Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse. For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). For at sikre løbende support viser vi desuden siden uden styles og JavaScript.
Viser en karrusel med tre dias på én gang. Brug knapperne Forrige og Næste til at flytte gennem tre dias ad gangen, eller brug skyderknapperne i slutningen til at flytte gennem tre dias ad gangen.
Siden udbruddet af coronavirus sygdom (COVID-19) i 2019 er mange kommercielle nukleinsyreamplifikationstests (NAAT'er) blevet udviklet rundt om i verden og er blevet standardassays. Selvom adskillige tests hurtigt blev udviklet og anvendt til laboratoriediagnostiske tests, er disse tests ydeevne ikke blevet evalueret i en række forskellige indstillinger. Derfor havde denne undersøgelse til formål at evaluere ydeevnen af ​​Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI og Sansure Biotech assays ved hjælp af Composite Reference Standard (CRS). Undersøgelsen blev udført på Ethiopian Public Health Institute (EPHI) fra 1. til 30. december 2020. 164 nasopharyngeale prøver blev ekstraheret ved hjælp af QIAamp RNA-minisættet og Abbott DNA-prøveforberedelsessystemet. Ud af 164 prøver var 59,1 % positive og 40,9 % negative for CRS. Sansure Biotech-positiviteten var signifikant lav sammenlignet med CRS (p < 0,05). Sansure Biotech-positiviteten var signifikant lav sammenlignet med CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotechs positive resultater var signifikant lavere sammenlignet med CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）.与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p < 0,05）. У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech havde signifikant færre positive resultater sammenlignet med CRS (p < 0,05).Den overordnede overensstemmelse mellem de fire analyser var 96,3-100 % sammenlignet med CRS. Ud over den lave positivitet i Sansure Biotech-analysen var ydeevnen af ​​de fire assays næsten sammenlignelig. Som sådan kræver Sansure Biotech [Research Only (RUO)] assayet yderligere validering for dets brug i Etiopien. Endelig bør yderligere forskning overvejes for at evaluere assays med passende producents påstande.
Laboratorietest er en del af Verdenssundhedsorganisationens (WHO) Strategisk Plan for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Beredskab og Respons (SPRP). WHO råder til, at landene skal opbygge laboratoriekapacitet for at forbedre beredskab, korrekt sagsbehandling, årvågenhed og hurtig reaktion på folkesundhedsudfordringer. Dette tyder på, at laboratoriets rolle er nøglen til at karakterisere sygdommen og epidemiologien af ​​nye smitsomme stoffer og kontrollere deres spredning.
Diagnosen af ​​COVID-19 kræver epidemiologiske og medicinske oplysninger, personlige symptomer/tegn og røntgen- og laboratoriedata2. Siden COVID-19-udbruddet blev rapporteret i Wuhan, Kina, er der udviklet mange kommercielle nukleinsyreamplifikationstests (NAAT'er) rundt om i verden. Real-time revers transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR) er blevet brugt som en rutine og standardmetode til laboratoriediagnose af svær akut respiratorisk syndrom 2 (SARS-CoV-2)3-infektion. Molekylær påvisning af SARS-CoV-2 er typisk baseret på N (nukleocapsidproteingenet), E (kappeproteingenet) og RdRp (RNA-afhængigt RNA-polymerasegen) gener i ORF1a/b (åben læseramme 1a/b). gen) område identificeret fra det virale genom. De anses for at være de vigtigste bevarede regioner fundet i virale genomer til virusgenkendelse4. Blandt disse gener har RdRp- og E-generne høj analytisk detektionsfølsomhed, mens N-genet har lav analytisk følsomhed5.
Ydeevnen af ​​PCR-assays kan variere afhængigt af forskellige faktorer såsom: ekstraktionsreagenser, amplifikations-/detektionsreagenser, ekstraktionsmetode, kvaliteten af ​​PCR-maskinen og andre instrumenter. Fra april 2020 har mere end 48 forskellige diagnostiske enheder fra ni lande modtaget Emergency Use Authorization (EUA) til COVID-196-diagnostik. I Etiopien bruges mere end 14 real-time PCR-platforme til PCR-detektion af SARS-CoV-2 på 26 offentlige sundhedsinstitutioner, herunder ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 og Quant-studio7. Derudover er forskellige PCR-testsæt tilgængelige, såsom Daan-gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test og SARS-CoV-2 BGI-test. Selvom rRT-PCR er meget følsom, rapporterer nogle patienter med COVID-19 falske negative resultater på grund af utilstrækkelige kopier af viral ribonukleinsyre (RNA) i prøver på grund af forkert indsamling, transport, opbevaring og håndtering samt laboratorietests. personalets forhold og handlinger8. Derudover kan prøve- eller kontrolfejlhåndtering, indstilling af cyklustærskel (Ct) og krydsreaktivitet med andre patogene nukleinsyrer eller inaktivt/rest SARS-CoV-2-RNA føre til falske positive resultater i rRT-PCR9-assays. Det er således klart, at PCR-tests faktisk kan identificere bærere af genfragmenter, da de ikke engang kan skelne mellem virkelig aktive virale gener, så testene kan kun identificere bærere og ikke patienter10. Derfor er det vigtigt at vurdere diagnostisk ydeevne ved hjælp af standardmetoder i vores omgivelser. Selvom mange NAAT-reagenser er tilgængelige på Ethiopian Public Health Institute (EPHI) og i hele landet, er der endnu ikke rapporteret nogen sammenlignende evaluering af deres effektivitet. Derfor sigtede denne undersøgelse på at evaluere den sammenlignende ydeevne af kommercielt tilgængelige kits til påvisning af SARS-CoV-2 ved rRT-PCR ved hjælp af kliniske prøver.
I alt 164 deltagere med mistanke om COVID-19 blev inkluderet i denne undersøgelse. Størstedelen af ​​prøverne var fra behandlingscentre (118/164 = 72 %), mens de resterende 46 (28 %) deltagere var fra ikke-behandlingscentre. Blandt deltagere, der ikke blev behandlet på centret, havde 15 (9,1%) klinisk mistænkte tilfælde, og 31 (18,9%) havde kontakter med bekræftede tilfælde. Treoghalvfems (56,7 %) deltagere var mænd, og deltagernes gennemsnitsalder (± SD) var 31,10 (± 11,82) år.
I denne undersøgelse blev positive og negative rater af fire tests for COVID-19 bestemt. Således var de positive rater af Abbott SARS-CoV-2 assay, Daan Gene 2019-nCoV assay, SARS-CoV-2 BGI assay og Sansure Biotech 2019-nCoV assay henholdsvis 59,1 %, 58,5 %, 57,9 % og 55,5 %. Den positive og negative sammensatte referencestandard (CRS) score var henholdsvis 97 (59,1%) og 67 (40,9%) (tabel 1). I denne undersøgelse var definitionen af ​​CRS baseret på reglen "enhver positiv", hvorved to eller flere testresultater, der gav det samme resultat, ud af fire testresultater blev betragtet som sande positive eller negative.
I denne undersøgelse fandt vi en negativ procentvis overensstemmelse (NPA) på 100% (95% CI 94,6-100) for alle analyser sammenlignet med CRS. Sansure Biotechnology-analysen viste en minimal PPA på 93,8 % (95 % CI 87,2-97,1), og Daan Gene 2019-nCoV-analysen havde en samlet overensstemmelse på 99,4 % (95 % CI 96,6-99,9). I modsætning hertil var den overordnede overensstemmelse mellem SARS-CoV-2 BGI-analysen og Sansure Biotech 2019-nCoV-analysen henholdsvis 98,8 % og 96,3 % (tabel 2).
Cohens kappa-koefficient for overensstemmelse mellem CRS og Abbott SARS-CoV-2-analyseresultater var fuldstændig konsistent (K = 1,00). Tilsvarende er Cohens kappa-værdier detekteret af Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI og Sansure Biotech 2019-nCoV også fuldt i overensstemmelse med CRS (K ≥ 0,925). I denne sammenlignende analyse viste chi-kvadrat-testen (McNemar-testen), at Sansure Biotech 2019-nCoV-analyseresultaterne var signifikant forskellige fra CRS-resultaterne (p = 0,031) (tabel 2).
Som vist i fig.1 procentdelen af ​​laveste Ct-værdi (< 20 Ct) af Abbott SARS-CoV-2-assay (kombineret RdRp- og N-gen) var 87,6 %, og ORF1a/b-gen-Ct-værdien af ​​Sansure Biotech 2019-nCoV-analyse viste, at procentdelen af ​​lav Ct-værdi (< 50 Ct. Ct) var 3,2 %. 1 procentdelen af ​​laveste Ct-værdi (< 20 Ct) af Abbott SARS-CoV-2-assay (kombineret RdRp- og N-gen) var 87,6 %, og ORF1a/b-gen-Ct-værdien af ​​Sansure Biotech 2019-nCoV-analyse viste, at procentdelen af ​​lav Ct-værdi (< 50 Ct. Ct) var 3,2 %.Som vist i fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) составил 87,6 Ct. Ot. анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) составлял 50,3%, а высокое значения (36 Ct) - 4 Ct. составляло 3,2%. 1, var procentdelen af ​​den laveste Ct-værdi (< 20 Ct)-analyse af Abbott SARS-CoV-2 (kombineret gen RdRp og N) 87,6 %, og Ct-værdien af ​​ORF1a/b-genanalysen af ​​Sansure Biotech 2019-nCoV viste, at procentdelen af ​​lav Ct-værdi (< 2, 2, % og høj Ct-værdi) udgjorde (36–40 Ct) udgjorde 3,2 %.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比三（< 20% Ct. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值Ct(36)的百分比为3,2 %. Som vist i figur 1 er den laveste Ct-værdi-procent (< 20 Ct) af Abbott SARS-CoV-2-test (kombination af RdRp- og N-gen) 87,6 %, ORF1a/b-gen-Ct-værdien for Sansure Biotech 2019-nCoV-test viser lav Ct值-procent (< 50.3 t) (< 50.3 %)高Ct 值(36–40 Ct) 的 procent er 3,2 %. Hvordan er det med рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое процентное процентное в 2 Ctчентое (2 Ctчентое) размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV показал низкий Ct. Som vist i figur 1 havde Abbott SARS-CoV-2-assayet (som kombinerer RdRp- og N-generne) den laveste procentvise Ct-værdi (< 20 Ct) på 87,6 %, mens Ct-værdien af ​​ORF1a/b-genet i Sansure Biotech 2019-studiet - Analysen af ​​nCoV viste en lav CV. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3 %, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2 %. Procentdelen af ​​værdier (< 20 Ct) var 50,3%, og procentdelen af ​​høje Ct-værdier (36-40 Ct) var 3,2%.Abbott SARS-CoV-2 B-testen registrerede Ct-værdier over 30. På den anden side havde ORF1a/b-genet på BGI SARS-CoV-2-analysen en høj Ct-værdi (> 36 Ct) procentdel var 4 % (fig. 1). På den anden side havde ORF1a/b-genet på BGI SARS-CoV-2-analysen en høj Ct-værdi (> 36 Ct) procentdel var 4 % (fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент которого состаля 1 (рисокое значение). På den anden side havde ORF1a/b i analysen af ​​BGI SARS-CoV-2-genet en høj Ct-værdi (> 36 Ct), hvoraf procentdelen var 4 % (fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分毼为分比为分比为 På den anden side, i BGI SARS-CoV-2-detektion, er procentdelen af ​​ORF1a/b-genet med høj Ct-værdi (>36 Ct) 4% (figur 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) составил 4% (рис.). På den anden side, i BGI SARS-CoV-2-analysen, var procentdelen af ​​ORF1a/b-gener med høje Ct-værdier (>36 Ct) 4% (fig. 1).
I denne undersøgelse tog vi 164 nasopharyngeale prøver. For alle typer assays blev RNA-isolering og amplifikation udført ved hjælp af metoder og kits anbefalet af de respektive producenter.
Denne undersøgelse viste, at Abbotts test for SARS-CoV-2 har samme detektionsydelse som CRS, med 100 % positiv, negativ og overordnet overensstemmelse. Cohens kappa-aftale er 1.00, hvilket indikerer fuld overensstemmelse med CRS. En lignende undersøgelse fra University of Washington i USA viste, at den samlede sensitivitet og specificitet af Abbott-testen for SARS-CoV-2 var henholdsvis 93 % og 100 % sammenlignet med det laboratoriebestemte assay (LDA) fra CDC. 11. Abbott SARS-CoV-2-detektionssystemet er baseret på den samtidige kombinerede påvisning af N- og RdRp-generne, da begge gener er mere følsomme, hvilket minimerer falske negativer12. En undersøgelse i Wien, Østrig viste også, at store ekstraktionsprøvevolumener og detektions-eluentvolumener minimerede fortyndingseffekter og øgede detektionseffektiviteten13. Abbotts perfekte match til SARS-CoV-2-assayet kan således forbindes med et platformsdetektionssystem, der samtidigt detekterer kombinatoriske gener, ekstraherer et stort antal prøver (0,5 ml) og bruger en stor mængde eluent (40 µl).
Vores resultater viste også, at detektionsydelsen af ​​Daan genetiske test var næsten den samme som CRS. Dette er i overensstemmelse med en undersøgelse14 udført på Anhui University i Huainan, Kina, og producentens påstand om 100 % positiv enighed. På trods af rapporter om konsistente resultater var én prøve falsk negativ efter gentestning af det samme eluat, men var positiv i Abbott SARS-CoV-2 og Sansure Biotech nCoV-2019 assays. Dette tyder på, at der kan være variation i resultater på tværs af forskellige typer assays. Ikke desto mindre var resultatet af Daan Gene-assayet i undersøgelsen udført i Kina15 signifikant anderledes (p < 0,05) sammenlignet med deres laboratoriedefinerede referenceassay. Ikke desto mindre var resultatet af Daan Gene-assayet i undersøgelsen udført i Kina15 signifikant anderledes (p < 0,05) sammenlignet med deres laboratoriedefinerede referenceassay. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) эталонного анализа. I en undersøgelse i Kina15 var Daan Genes analyseresultat dog signifikant anderledes (p < 0,05) fra deres laboratoriereferenceanalyse.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05）.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значительно отличались в поюсра (p < 0,05) его эталонным лабораторным тестом. I en undersøgelse i Kina15 var resultaterne af Daans genetiske test dog signifikant forskellige (p < 0,05) sammenlignet med dens referencelaboratorietest.Denne uoverensstemmelse kan skyldes referencetestens følsomhed til at påvise SARS-CoV-2, og yderligere undersøgelser kan være vigtige for at fastslå årsagen.
Derudover evaluerede vores undersøgelse den sammenlignende ydeevne af SARS-CoV-2 BGI-analysen med CRS, der viste fremragende positiv procentvis overensstemmelse (PPA = 97,9%), negativ procentvis overensstemmelse (NPA = 100%) og samlet procentvis overensstemmelse efter køn (OPA). ). = 98,8%). Cohens Kappa-værdier viste god overensstemmelse (K = 0,975). Undersøgelser i Holland16 og Kina15 har vist konsistente resultater. SARS-CoV-2 BGI-testen er en enkelt gen (ORF1a/b) påvisningstest ved brug af 10 µl amplifikations-/detektionseluat. På trods af god statistisk overensstemmelse med vores referenceresultater savnede analysen to positive prøver (1,22 %) af den samlede prøve. Dette kan have enorme kliniske implikationer for transmissionsdynamikken på både patient- og samfundsniveau.
En anden sammenlignende analyse inkluderet i denne undersøgelse var Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) assay; den samlede matchprocent var 96,3%. Enighedens styrke blev også bestemt af Cohen's Kappa-værdien, som var 0,925, hvilket indikerer fuld overensstemmelse med CRS. Igen er vores resultater identiske med undersøgelser udført på Central South University i Changsha, Kina, og på den kliniske laboratorieafdeling på Liuzhou People's Hospital, Liuzhou City, Kina17. Selvom ovenstående gode statistiske overensstemmelse blev registreret, viste chi-kvadrat-testen (MacNemar-testen), at resultatet af Sansure Biotech-analysen har haft en statistisk signifikant forskel sammenlignet med CRS (p < 0,005). Selvom ovenstående gode statistiske overensstemmelse blev registreret, viste chi-kvadrat-testen (MacNemar-testen), at resultatet af Sansure Biotech-analysen har haft en statistisk signifikant forskel sammenlignet med CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критратерикий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие på сравнению с CRS (p. 5 <). Selvom den gode statistiske overensstemmelse ovenfor blev registreret, viste chi-kvadrat-testen (McNemar-testen), at resultatet af Sansure Biotech-analysen havde en statistisk signifikant forskel sammenlignet med CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）桨明，Sansure CR Biotech相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 桨明 , san biotech ，与 crs 相比 具有 显着 （(p <0,005。。。。。。。。。。… Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Макрамакне) статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech og CRS. På trods af den gode statistiske overensstemmelse, der er nævnt ovenfor, viste chi-kvadrat-testen (McNemar-testen) en statistisk signifikant forskel (p < 0,005) mellem Sansure Biotech-analysen og CRS.Seks prøver (3,66 %) viste sig at være falsk negative sammenlignet med CRS (Supplerende tabel 1); dette er meget vigtigt, især i betragtning af dynamikken i transmissionen af ​​virussen. Ovenstående data understøtter også denne lave detektionsrate15.
I denne undersøgelse blev Ct-værdier bestemt for hver assay og respektive platform, med den laveste gennemsnitlige Ct-værdi rapporteret i Abbott SARS-CoV-2-assayet. Dette resultat kan være relateret til Abbotts simultane kombinerede genetiske testsystem til påvisning af SARS-CoV-2. Derfor havde 87,6 % af Abbott SARS-CoV-2-resultaterne ifølge figur 1 Ct-værdier under 20. Kun et lille antal prøveresultater (12,4 %) var i intervallet 20-30. Ct-værdier over 30 blev ikke registreret. Ud over Abbotts brug af SARS-CoV-2 panelets genetiske testformat, kan dette resultat være relateret til den nedre detektionsgrænse (32,5 RNA kopier/ml)18, som er tre gange lavere end virksomhedens nedre grænse på 100 RNA kopier/ml. ml)19.
Denne undersøgelse har nogle begrænsninger: For det første har vi ikke standard-/referencemetoder [såsom viral load eller andre laboratorietests (LDA)] på grund af mangel på ressourcer. For det andet var alle prøver, der blev brugt i denne undersøgelse, nasopharyngeale podninger, mens resultaterne ikke var anvendelige for andre prøvetyper, og for det tredje var vores prøvestørrelse lille.
Denne undersøgelse sammenlignede ydeevnen af ​​fire rRT-PCR-assays for SARS-CoV-2 ved hjælp af nasopharyngeale prøver. Alle detektionsassays havde næsten sammenlignelig ydeevne, med undtagelse af Sansure Biotech-analysen. Desuden blev den lave positivitetsrate identificeret i Sansure Biotech-analysen sammenlignet med CRS (p < 0,05). Desuden blev den lave positivitetsrate identificeret i Sansure Biotech-analysen sammenlignet med CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Derudover viste Sansure Biotech-testen en lav procentdel af positive resultater sammenlignet med CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p < 0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Derudover havde Sansure Biotech-analysen en lavere positivitetsrate sammenlignet med CRS (p < 0,05).Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO)-analysen af ​​PPA, NPA og overordnet overensstemmelse oversteg 93,5 % med en Cohen Kappa-styrke af overensstemmelsesværdi på 0,925. Endelig har Sansure Biotech Assay (RUO) behov for yderligere validering til brug i Etiopien, og yderligere forskning bør overvejes for at evaluere påstande fra individuelle producenter.
Sammenlignende undersøgelsesdesign blev udført på fire sundhedsfaciliteter i Addis Abeba, Eka Kotebe Hospital, Millennium Church Treatment Centre, Zewooditu Memorial Hospital og St. Peter's Tuberculosis Specialist Hospital. Dataene blev indsamlet mellem 1. og 31. december 2020. De medicinske faciliteter til denne undersøgelse blev målrettet udvalgt baseret på deres høje antal tilfælde og tilgængeligheden af ​​større behandlingscentre i byen. Tilsvarende blev instrumenter, inklusive ABI 7500 og Abbott m2000 real-time PCR-instrumenterne, udvalgt i henhold til anbefalingerne fra NAAT-reagensproducenterne, og fire PCR-detektionskit blev udvalgt til denne undersøgelse, da de fleste laboratorier i Etiopien brugte mindst fire af dem. Gentest, Abbott SARS-CoV-2-test, Sansure Biotech-test og SARS-CoV-2 BGI-test udført under undersøgelsen).
Testning for SARS-CoV-2 blev udført fra 1. til 30. december 2020 ved hjælp af 3 ml Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Kina) fra personer under undersøgelse for COVID-19, der henvises til EPHI. Nasopharyngeale prøver blev indsamlet af trænede prøvesamlere og sendt til EPHI i tredobbelte pakker. Forud for nukleinsyreisolering tildeles hver prøve et unikt identifikationsnummer. Ekstraktion udføres fra hver prøve umiddelbart efter ankomsten ved hjælp af manuelle og automatiske ekstraktionsmetoder. Til den automatiske ekstraktion af Abbott m2000 blev 1,3 ml (inklusive 0,8 ml dødvolumen og 0,5 ml ekstraktionsindløbsvolumen) af prøven ekstraheret fra hver prøve og passeret gennem Abbott DNA Sample Preparation System (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA). ) En batch på 96 [92 prøver, to detektionskontroller og to ikke-skabelonkontroller (NTC)] blev inkluderet i den overordnede proces (hentning og påvisning) af to runder af SARS-CoV-2 (EUA) i realtid. minedrift. Til manuel ekstraktion skal du på samme måde bruge de samme prøver (til automatisk ekstraktion og opdagelse). Under hele processen blev 140 µl prøver således opdelt og ekstraheret ved hjælp af QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland) i batches af 24 (inklusive 20 prøver, to assaykontroller og to NTC'er) over ni runder. Manuelt ekstraherede eluater blev amplificeret og detekteret ved hjælp af en ABI 7500 termisk cycler under anvendelse af SARS-CoV-2 BGI-assay, Daan Gene-assay og Sansure Biotech-assay.
Automatiseret isolering og oprensning af SARS-CoV-2 viralt RNA følger det magnetiske perleprincip ved hjælp af Abbott DNA-prøvepræparationsreagenser. Inaktivering af prøver og solubilisering af virale partikler udføres under anvendelse af et detergent indeholdende guanidin isothiocyanat for at denaturere proteinet og inaktivere RNase. RNA'et separeres derefter fra proteinet ved fastfaseseparation ved hjælp af silica, dvs. guanidiniumsaltet og lysisbufferens alkaliske pH fremmer bindingen af ​​nukleinsyrerne til silicaen (SiO2). Skylletrinnet fjerner resterende proteiner og snavs for at producere en klar opløsning. Transparent RNA isoleres fra silica-baserede mikropartikler ved hjælp af instrumentets magnetfelt20,21. På den anden side udføres manuel isolering og oprensning af RNA ved spin-søjlemetoden under anvendelse af centrifugering i stedet for et magnetisk stativ og adskillelse af mikropartikler fra eluenten.
Abbott Real-Time SARS-CoV-2 Detection Test (Abbott Molecular, Inc.) blev udført i henhold til producentens instruktioner, som modtog EUA19,22 fra WHO og FDA. I denne protokol blev prøveinaktivering før ekstraktion udført i et vandbad ved 56 °C i 30 minutter. Efter virusinaktivering blev nukleinsyreekstraktion udført på et Abbott m2000 SP-instrument fra 0,5 ml VTM under anvendelse af et Abbott m2000 DNA-prøveforberedelsessystem. ifølge producenten. Amplifikation og detektion blev udført under anvendelse af et Abbott m2000 RT-PCR-instrument, og dobbeltdetektion blev udført for RdRp- og N-generne. ROX) og VIC P (proprietært farvestof) til målretning og detektion af interne kontroller, hvilket muliggør samtidig påvisning af begge amplifikationsprodukter 19 .
Amplifikationsdetektionsmetoden i dette kit er baseret på et-trins RT-PCR-teknologi. ORF1a/b- og N-generne blev udvalgt som konserverede regioner af Daan Gene Technology for at detektere målregion-amplifikation. Specifikke primere og fluorescerende prober (N-genprober mærket med FAM, ORF1a/b-prober mærket med VIC) er blevet designet til at påvise SARS-CoV-2 RNA i prøver. Den endelige eluent og masterblandinger blev fremstillet ved at tilsætte 5 µl eluent til 20 µl af masterblandingen til et slutvolumen på 25 µl. Amplifikation og detektion blev udført samtidigt på et ABI 750024 real-time PCR instrument.
ORF1a/b- og N-generne blev påvist ved hjælp af Sansure Biotech nCoV-2019 Nucleic Acid Diagnostic Kit (fluorescerende PCR-detektion). Forbered specifikke prober for hvert målgen ved at vælge FAM-kanalen for ORF1a/b-regionen og ROX-kanalen for N-genet. Til dette assaykit tilsættes eluent- og mastermix-reagenser som følger: klargør 30 µl mastermix-reagens og 20 µl elueret prøve til påvisning/amplifikation. Real-time PCR ABI 750025 blev brugt til amplifikation/detektion.
SARS-CoV-2 BGI-testen er et fluorescerende rRT-PCR-kit i realtid til diagnosticering af COVID-19. Målregionen er placeret i ORF1a/b-regionen af ​​SARS-CoV-2-genomet, som er en enkelt gendetektionsmetode. Derudover er det humane husholdningsgen β-actin et internt reguleret målgen. Masterblandingen fremstilles ved at blande 20 µl af mastermix-reagenset og 10 µl af den ekstraherede RNA-prøve i en brøndplade26. Et ABI 7500 fluorescerende kvantitativt realtids-PCR-instrument blev brugt til amplifikation og detektion. Al nukleinsyreamplifikation, PCR-kørselsbetingelser for hvert assay og fortolkning af resultater blev udført i overensstemmelse med den respektive producents instruktioner (tabel 3).
I denne sammenlignende analyse brugte vi ikke referencestandardmetoden til at bestemme procent overensstemmelse (positiv, negativ og overordnet) og andre sammenligningsparametre for de fire analyser. Hver testsammenligning blev udført med CRS, i denne undersøgelse blev CRS sat af reglen "enhver positiv", og resultatet blev bestemt, ikke ved en enkelt test, vi brugte mindst to matchede testresultater. I tilfælde af COVID-19-overførsel er falske negative resultater desuden farligere end falske positive resultater. For at sige "positivt" så nøjagtigt som muligt ud fra et CRS-resultat, skal mindst to assaytest være positive, hvilket betyder, at mindst ét ​​positivt resultat sandsynligvis kommer fra en EUA-analyse. Ud af fire testresultater anses to eller flere testresultater, der giver det samme resultat, som sande positive eller negative18,27.
Data blev indsamlet ved hjælp af strukturerede dataudtræksformularer, dataindtastning og analyse blev udført ved hjælp af Excel statistisk software og SPSS version 23.0 til beskrivende statistik. Positiv, negativ og samlet procent overensstemmelse blev analyseret, og en Kappa-score blev brugt til at bestemme graden af ​​overensstemmelse for hver metode med CRS. Kappa-værdier fortolkes som følger: 0,01 til 0,20 for mild overensstemmelse, 0,21 til 0,40 for generel overensstemmelse, 0,41-0,60 for moderat overensstemmelse, 0,61-0,80 for større overensstemmelse og 0,81-0,99 for fuldstændig overensstemmelse28.
Etisk godkendelse blev opnået fra University of Addis Abeba, og alle eksperimentelle protokoller for denne undersøgelse blev godkendt af Ethiopian Public Health Institute's Scientific Ethics Review Board. Referencenummeret for EPHI Ethics License er EPHI/IRB-279-2020. Alle metoder blev anvendt i overensstemmelse med anbefalingerne og bestemmelserne i de etiopiske nationale omfattende retningslinjer for behandling af COVID-19. Derudover blev der indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle undersøgelsesdeltagere forud for deltagelse i undersøgelsen.
Alle data opnået eller analyseret i denne undersøgelse er inkluderet i denne publicerede artikel. Data, der understøtter resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra den respektive forfatter efter rimelig anmodning.
Verdenssundhedsorganisationen. Anbefalinger for laboratorieteststrategier for COVID-19: Midlertidig vejledning, 21. marts 2020 nr. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 smart diagnose i Akutafdelingen: All-in i praksis. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI COVID-19 smart diagnose i Akutafdelingen: All-in i praksis.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. og Gurgulianis, KI Intelligent diagnose af COVID-19 i akutmodtagelsen: alt i praksis.Muliou DS, Pantazopoulos I. og Gurgulyanis KI Intelligent diagnose af COVID-19 i akutmodtagelser: end-to-end integration i praksis. Ekspert pastor Respire. medicin. 3, 263-272 (2022).
Mitchell, SL & St George, K. Evaluering af COVID19 ID NOW EUA-analysen. Mitchell, SL & St George, K. Evaluering af COVID19 ID NOW EUA-analysen.Mitchell, SL og St. George, K. Evaluering af COVID19 ID NOW EUA-analysen.Mitchell SL og St. George K. Evaluering af COVID19 ID NOW EUA-analysen. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
WHO. Laboratoriepåvisning af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) i mistænkt human sygdom. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (tilgået 15. august 2020) (WHO, 2020).
Udugama, B. et al. COVID-19-diagnose: Sygdomme og testværktøjer. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Etablering af College of Pathologists of Eastern, Central and Southern Africa – Regional School of Pathology i Mellemøsten og Sydafrika. Afrika. J. Lab. medicin. 9(1), 1-8 (2020).
Etiopisk Institut for Folkesundhed, Føderale Sundhedsministerium. Midlertidig national strategi og vejledning for laboratoriediagnose af COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (tilgået 12. august 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falsk negative tests for SARS-CoV-2-infektionsudfordringer og implikationer. Woloshin, S., Patel, N. & Kesselheim, AS Falsk negative tests for SARS-CoV-2-infektionsudfordringer og implikationer.Voloshin S., Patel N. og Kesselheim AS Falsk-negative tests for SARS-CoV-2-infektioner og deres konsekvenser.Voloshin S., Patel N. og Kesselheim AS Falsk-negative tests for provokation og virkningen af ​​SARS-CoV-2-infektion. N. eng. J. Medicin. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falsk-positive og falsk-negative COVID-19-tilfælde: Respiratorisk forebyggelse og håndteringsstrategier, vaccination og yderligere perspektiver. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falsk-positive og falsk-negative COVID-19-tilfælde: Respiratorisk forebyggelse og håndteringsstrategier, vaccination og yderligere perspektiver. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI. вакцинация и дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Falsk positive og falsk negative tilfælde af COVID-19: respiratorisk forebyggelse og behandlingsstrategier, vaccination og vejen frem.Muliu, DS og Gurgulianis, KI Falsk-positive og falsk-negative tilfælde af COVID-19: strategier for respiratorisk forebyggelse og behandling, vaccination og vejen frem. Ekspert pastor Respire. medicin. 15(8), 993-1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19 diagnose i akutmodtagelsen: At se træet, men miste skoven. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. COVID-19 diagnose i akutmodtagelsen: At se træet, men miste skoven.Mouliou, DS, Ioannis, P. og Konstantinos, G. COVID-19 Diagnose i Akutafdelingen: Se træet, tab skoven.Muliou DS, Ioannis P. og Konstantinos G. COVID-19-diagnose på skadestuer: Ikke nok skov til træerne. Vises. medicin. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validering og validering af den analytiske og kliniske ydeevne af Abbott RealTime SARS-CoV-2-analysen. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning af fem primersæt fra forskellige genomregioner af COVID-19 til påvisning af virusinfektion ved konventionel RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning af fem primersæt fra forskellige genomregioner af COVID-19 til påvisning af virusinfektion ved konventionel RT-PCR.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. og Aflatunyan, B. Sammenligning af fem sæt primere fra forskellige regioner af COVID-19-genomet til påvisning af viral infektion ved konventionel RT-PCR. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. & Aflatoonian, B. Sammenligning af 5 forskellige genetiske regioner af COVID-19 til påvisning af virusinfektion ved konventionel RT-PCR.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. og Aflatunyan B. Sammenligning af fem sæt primere fra forskellige regioner af COVID-19-genomet til påvisning af virusinfektion ved konventionel RT-PCR.Iran. J. Mikrobiologi. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Foreløbige resultater af det nationale eksterne kvalitetsvurderingsprogram til påvisning af SARS-CoV-2 genomsekvenser. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Analytisk evaluering af effektiviteten af ​​fem RT-PCR-sæt til alvorligt akut respiratorisk syndrom Coronavirus 2. J. Clinical. laboratorium. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Evaluering af syv kommercielt tilgængelige SARS-CoV-2 RNA-detektionskit i Kina baseret på realtidspolymerasekædereaktion (PCR). klinisk. Kemisk. laboratorium. medicin. 58(9), e149-e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Sammenligning af syv kommercielle RT-PCR COVID-19 diagnostiske kits. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Sammenligning af diagnostisk ydeevne af to PCR-sæt til påvisning af SARS-CoV-2-nukleinsyrer. J. Clinical. laboratorium. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. En sammenlignende undersøgelse af fire SARS-CoV-2 nukleinsyreamplifikationstestplatforme (NAAT) viste, at ID NOW ydeevne var signifikant forringet afhængigt af patient og prøvetype. diagnose. mikrobiologi. Inficere. diss. 99(1), 115200 (2021).
Abbott molekyle. Abbott SARS-CoV-2 analyse i realtid. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (Fra 10. august 2020) (2020).
Klein, S. et al. SARS-CoV-2 RNA-isolering ved hjælp af magnetiske perler til hurtig påvisning i stor skala ved RT-qPCR og RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).